Крысбургеры

В комментах к постам о секвенировании ДНК камрад myelencephalon дал интересную ссылку на виртуальную ПЦР-лабораторию. Сама "виртуальность" там - полная лабуда, но зато в награду за просмотр некотрого количества псевдоинтерактивных слайдов в конце есть очень хорошая анимация самого процесса амплификации, наглядно объясняющая, за счет чего происходит размножение конкретного кусочка ДНК.

Только что заметил повторяющуюся ошибку в своих постах про секвенирование ДНК: везде на автомате писал "комплИментарный". Следует читать - "комплЕментарный".

Чтобы тему закрыть: совсем кратко о новом модном методе чтения генома - пиросеквенировании.

Любопытна история метода. Первые наработки насчет пиросеквенирования появились еще в начале 90-х, но в дело тогда не пошли: до промышленного применения технологию довели только лет пять как. Сейчас в литературе метод довольно часто назвают "секвенированием по Ротбергу", хотя Ротберг его непосредственным разработчиком не является. Т.е. он, конечно, ученый-генетик, и не из последних, но гораздо важнее, что он миллионер. История опять вполне мексиканская. Несколько лет назад у него родился сын, но не задышал - попал в интенсивную терапию на аппарат. Папа запаниковал и вбил себе в голову, что у ребенка генетический дефект. Поскольку деньги есть - паниковал папа с размахом: решил отсканировать весь геном сына и разобраться с проблемой во всеоружии. Однако по Сэнгеру это заняло бы много лет и стоило бы столько, что даже миллионер не потянет. Поэтому папа основал «454 Life Science Corp.» и поставил перед ней задачу: создать такой метод чтения ДНК, какого еще не бывало. Чтобы немедленно и за реальные деньги — ну хотя бы миллионы, а не миллиарды...

Совсем быстро, однако, не получилось: ребенка успели вылечить по старинке. Зато папа теперь станет еще богаче. С помощью нового метода можно прочесть 25 миллионов пар оснований (это весь геном низшего гриба) за четыре часа, а три миллиарда нуклеотидов, составляющих геном человека, — за сто дней, стоимость же такого проекта, по предварительным оценкам, составит около десяти тысяч долларов. Метод сейчас активно используется для секвенирования вирусных ДНК/РНК. Вирус свиного гриппа читали именно так. Плюс огромная экономия на подготовительных процессов: по Сэнгеру, если стоит задача не известные fingerprints снять для криминалистических целей с помощью готового набора праймеров, а читать что-то новое - то чуть ли не три недели занимает выращивание культур бактерий, с помощью ферментов которых будут резать ДНК в нужных местах (в деталях вот этого процесса я не копался, так что могу что-то переврать).

Кстати, одному из первоткрывателей ДНК - Джеймсу Уотсону - геном уже секвенировали на память потомкам. Насколько я понимаю - в рекламных целях.

Метод интересен не столько биохимически (в основе все та же ПЦР), сколько технологически. Сплошной нанотех:

1. Берем выделенный образец ДНК, которую надо читать, денатурируем (разрываем на отдельные нити) и случайным образом с помощью ферментов рубим их на мелкие кусочки.
2. Разбавляем раствор до такой степени, чтобы крупинка за крупинкой гонялась с дубинкой. Добавляем в него специальный ноу-хау-порошок, состоящих из бусинок диаметром 28 микрометров. Бусинки - "липкие" для ДНК. Поскольку из-за сильного разведения кусочков ДНК на единицу объема раствора очень мало - то к большинству бусинок прилипает только один кусочек ДНК.
3. Добавляем в расвор минеральное масло и взбиваем его в эмульсию. Капельки масла окружают крупинки, и в результате у нас получается нечто вроде изолированных микрореакторов. Ну или примитивного рукотворного клеточного ядра: капли масла за счет поверхностного натяжения удерживают все необходимые реагенты вокруг бусинки с единственным кусочком ДНК
4. Проводим обычную ПЦР, в результате чего единичные кусочки ДНК размножаются (это нужно для усиления получаемого при дальнейших реакциях). Бусинки обрастают ДНК-хвостами. Растворяем и удаляем масло.
5. Зазливаем полученный раствор в специальную реакционную пластину. Пластина представляет собой прозрачный планшет с сотами - нечто вроде поддона для изготовления кубиков льда в холодильниках, только диаметр каждой ячейки 44 микрометра, объем — 75 пиколитров. В результате в каждую ячейку попадает только одна бусинка (а некоторые и вовсе пустыми остаются). Пластина закрывается покровным стеклом так, что над ячейками остается немного пространства для протока реагентов, но настолько мало, что бусинки уже не могут выскочить из своих ячеек.
6. Заряжаем пластину в специальный аппарат, который с помощью высокоточного насоса (похожего на те, что применяют в струйных принтерах) начинает подавать в ячейку по очереди растворы четырех нуклеотидов - AGTC, смешанные с ферментами и прочей необходимой химией для реакции полимеризации ДНК. Прокачал один, промыл, прокачал следующий - и так по кругу многократно. Что при этом происходит? Кусочки ДНК, как и положено, начинают достраиваться комплиментарными нуклеотидами. Т.е. в первый цикл (если мы подаем раствор А) достроятся молекулы только в тех ячейках, где кусочки начинаются с Т и т.д. И вот тут, собственно, только и начинается собственно применение метода, разработанного в девяностые, когда было замечено, что в присутствии специального фермента - пирофосфата при присоединении очередного нуклеотида к цепи возникает слабая флюоресценция. Т.е. в тех ячейках, где произошла реакция - возникает вспышка света. Дальше - дело техники: пластинку снимает высокочувствительная цифровая камера (матрицу которой приходится охлаждать, чтобы снизить шумы), каждая вспышка соотносится с определенной микроячейкой и подаваемым в данный момент раствором, полученные последовательности обрабатываем на компе, склеиваем, получаем результат.
7. ...
8. PROFIT

( Картинка для наглядности )

В общем, все намного более технологично. Без пробирок и возни с реагентами на начальном этапе и тут не обойтись, но все-таки уже более "цифрово".

( Пиросеквенатор выглядит вот так )

( И заменяет вот такую батарею сенгеровских машин )

Метод, однако, не идеален: он в целом менее точен, чем сэнгеровский. В частности, хуже считываются длинные последовательности одинаковых нуклеотидов (думаю, причины поймете сами). За скорость надо платить.

В заключение отмечу, что сейчас ведутся активные работы по созданию прямых считываетелей ДНК (чиповых секвенаторов). Идея состоит в том, чтобы протягивать молекулу ДНК сквозь нанопору, сформированную на подложке микросхемы, и читать ее по мере прохождения, подобно магнитофонной ленте. При реализации такой технологии мы получим возможность встраивать считыватели генома (ну, хотя бы на уровне DNA-fingerprints) чуть ли не в бытовые КПК.

Дело, однако, явно не завтрашнее (собственно, датчиков, считывающих, какой именно нуклеотид мимо него идет, пока не придумали, насколько я понимаю: все пишут только о созданни "лентопротяжного механизма", а еще точнее - о валиках для него). Но, похоже, послезавтрашнее.

----
Использованные материалы (в порядке нарастания мозгодробительности):
http://bio.fizteh.ru/student/biotech/2006/dna_chtenie_28042006.html.
http://biomolecula.ru/content/214
http://molbiol.ru/bio/001/001.html

Окончание. Начало - тут.

В предыдущей серии мы рассматривали вариант с получением "DNA fingerprints", т.е. нас не интересовал код как таковой, интересовали только индивидуальные различия, по которым можно идентифицировать носителя. Однако не во всех случаях этого достаточно даже для судебной медицины (см., например, историю с близнецами-алиментщиками). Тем более недостаточно этого для исследований типа полного скана генома человека.

Для непосредственного чтения последовательностей нуклеотидов в цепи ДНК в промышленных масштабах долгое время существовал один основной метод - секвенирование (от англ. sequence) по Сенгеру (более ранние и громоздкие мы рассматривать не будем, это уже чистая химия, которая за пределы исследовательских лабораторий практически не выходила).

( Как он работает? )

Да, кстати. Чуть не проглядел.

С 1.01.2009 в России начал действовать закон о геномной регистрации.

Правда, на практике ни ИС, ни стандарты под него еще не утверждены.

Итак, про анализ ДНК.

Сначала два предуведомления.

1. Процесс анализа по сути своей оказался чудовищно сложный. Хотя я прочитал два десятка статей - я вовсе не претендую на то, что разобрался в нем хоть сколько-нибудь детально - скорее, просто уловил общие принципы. Так что в тексте ниже есть, с одной стороны, сознательные упрощения, с другой - мои собственные недопонятки. Часть из них я осознаю и пометил, часть наверняка прошляпил, если у кого из читателей есть что дополнить и поправить - добро пожаловать в комменты. В любом случае этот текст - не справочник и не учебник, а только материал, от которого вы можете оттолкнуться в дальнейших поисках инфы. Что еще важно: на самом деле и самих методов, и вариантов их реализаций очень много. Я постараюсь это оговаривать по тексту, но не слишком усердно, иначе получится совсем уж многокилометровая диссертация.

2. Несмотря на всю сложность, технология процесса уже доведена до уровня, доступного рядовому лаборанту. Прежде всего я нашел ответ на вопрос, беспокоивший меня при просмотре сериалов типа CSI: то, что они на любой чих делают тест ДНК - это киношные сказки или имеет связь с реальностью? У нас-то такая экспертиза пока еще экзотика. Оказалось - чистая правда! Примерно с начала 90-х годов американская криминалистика (а также криминалистика других развитых стран) начала отказываться от традиционных серологических методов анализа, поскольку ДНК-типирование стало доступно повсеместно, и при этом дает гораздо более точные и полезные результаты. Т.е. знакомые по старым детективам исследования на группу крови и т.п. ушли в прошлое. Более того, в США действует масштабная программа по перепроверке результатов прошлых экспертиз методами ДНК-тестов. На форуме судебных медиков нашел такую статистику: ошибки традиционных серологических методов находятся на втором месте среди причин, приведших к ошибочному осуждению после ошибок свиделей (фразу "врет, как свидетель" - все знают, так что это не сюрприз). 51%!!! А у ДНК-методов - 1%. Естественно, ДНК-типирование - развлечение все еще не дешевое, но тем не менее уже и не запредельно дорогое. Себестоимость некоторых экспертиз простыми безаппаратными методами (см. ниже) уже упала до сотен рублей (на том же судмедфоруме приведен подсчет, согласно которому предварительное типирование сотни подозреваемых обошлось бы всего в 3000 рублей - задача стояла сузить круг для проведения уже окончательной детальной экспертизы).

Вот что "голливудщина" - так это скорость выполнения тестов. В кино их делают - раз-два-готово, в реале это при самом лучшем раскладе - несколько дней. Но это я считаю допустимой уступкой зрелищности. Рентгеновские снимки с анализами в ER тоже приносят с нечеловеческой быстротой.

( Ну, поехали )